Fiksasyon Nedir

Fiksasyon Nedir 

Fiksasyon, klasik doku takip işleminin ilk aşamasıdır. Dokunun canlı organizmadaki durumuna en yakın şekilde sabitlenip (protoplazmadaki protein, lipid, karbonhidrat ve diğer maddeleri koagüle veya presipite ederek), dış etkenlere dirençli hale getirilmesidir.

Fiksasyon işleminde başlıca hedefler şunlardır 

1.   Hücresel enzimlerin neden olacağı otolizi önlemek,

2.  İnfeksiyöz ajanları inaktive etmek/öldürmek ve bakteriyel hasarı önlemek,

3.   Dokuyu şekil ve hacim açısından sabitleştirmek,

4.   Dokunun canlıdaki yapısına olabildiğince benzer şekilde korunmasını sağlamak,

5.   Dokuyu daha sonra uygulanacak takip işlemlerine dayanıklı hale getirmek,

6.   Dokuyu daha sonra uygulanacak boyama ve inceleme yöntemlerine elverişli hale getirmek. 

Tespit için kullanılan ajanlar fiksatif olarak adlandılır. Maalesef yukarıda sıralanan fiksasyon hedeflerinin tümünü karşılayan tek bir fiksatif mevcut değildir. Günümüze kadar, her biri bir ya da birkaç açıdan diğerinden üstün, farklı yapıda çeşitli fiksatifler üretilmiştir. Bu fiksatifler aşağıdaki gibi sınıflandırılmaktadır: 

1.   Aldehitler (formaldehit, gluteraldehit, glyoxal, acrolein),

2.   Oksitleyiciler (osmium tetroksid, potasyum permanganat, potasyum dikromat),

3.   Protein denatürasyonu yapanlar veya koagülanlar (etil alkol, metil alkol, asetik asit),

4.   Çapraz bağ yapan diğer ajanlar (carbodiiminler),

5.   Fiziksel ajanlar (ısı, mikrodalga),

6.   Diğerleri (civa klorür, pikrik asit, boya maddeleri).

Uzunca bir süredir, patoloji labortuvarlarının genelinde yaygın şekilde kullanılan fiksatif, aldehit grubu fiksatiflerden olan formalindir. Patolojide kullanılan diğer fiksatifler arasında Carnoy gibi alkol bazlı fiksatifler yanısıra, formaldehit içeren Bouin ve B5 gibi fiksatifler bulunmaktadır.

Fiksatif Nedir Fiksatifler ve Ozellikleri

Fiksatif Nedir, Günümüzde Kullanılan Fiksatifler ve Özellikleri

Evrensel Fiksatif: Formalin

Uzunca bir süredir dünya genelinde, patoloji laboratuvarlarında standart fiksatif olarak kullanılagelmiş bu kıymetli solüsyonun patolojideki yerini anlayabilmek için, dokudaki etkisini ve bu etkiyi nasıl gerçekleştirdiğini bilmek önemlidir. Dolayısıyla öncelikle, doku formalin ile karşılaştığında kimyasal ve moleküler düzeyde nelerin olup bittiğine göz atmak gerekir.

Formalin, formaldehitin sudaki %40’lık çözeltisidir. Patoloji laboratuvarlarında, standart fiksatif olarak, 1 hacim formalinin (formalinin, formaldehitin %40’lık çözeltisi olduğunu tekrarlamak istiyorum!) 9 hacim su ile karıştırılmasıyla elde edilen “%10’luk formalin” kullanılmaktadır. Dolayısıyla %10’luk formalin, formaldehitin sudaki %4’lük çözeltisidir (40/100x10/100=4/100).

Aldehitler olarak bilinen organik molekül sınıfının en basit üyesi olan formaldehit (CH₂O), solüsyon içerisinde polimerize olma eğilimindedir. Yani, monomerik subünitler (CH₂O) bir araya gelerek, molekül ağırlığı daha yüksek agregatlar oluştururlar. %10’luk formalin içerisinde ise, formaldehit genellikle monomerik formda bulunur. Ancak fiksasyon ile polimerizasyon belirginleşmeye başlar ve polimerizasyon ile de molekül ağırlığı artan formaldehit moleküllerinin penetrasyon hızı yavaşlar (moleküler ağırlık ve penetrasyon hızı genellikle ters orantılıdır). Bu nedenle de, üreticiler, polimerizasyonun önüne geçmeye yardımcı olması amacıyla, formalin solüsyonuna metanol eklerler. Metanol her ne kadar bir alkol olsa da (bir aldehit değil) görece formaldehite yakındır. İki molekül arasındaki tek fark şudur: metanolde C ve O atomları tek bağ ile bağlı iken (C-OH); aldehitte C ve O atomları çift bağ ile bağlıdır (H-C=O). Bu da ayrıca metanolün vücuda neden toksik olduğunu gösterir. Sindirilmiş ya da absorbe edilmiş metanol, vücutta formaldehite ve formaldehitin oksidasyon ürünü olan formik asite oksidize edilir (oksidasyon zinciri metanol-formaldehit-formik asit şeklinde gider).

Formaldehit, non-koagülan bir fiksatiftir. Dokuya kimyasal olarak bağlanırken, kendinden sonra gelen belirtecin penetrasyonunu engelleyecek jel-benzeri bir matriks oluşumuna neden olmaz. Formaldehitin başlıca bağlandığı doku kısımları, aminoasitlerde (aa) bulunan reaktif hidrojen atomlarıdır. Bütün aa’ler, molekülün bir ucunda bir amino grubu (-NH₂) ve diğer uçta ise bir karboksil grubu (-CO₂H) içerir. Böylelikle bir protein oluşturmak üzere biraraya gelip bağlandıklarında, proteinin bir ucu bir amino grubu (N-terminali), diğer ucu ise bir karboksil grubu (C-terminali) olacaktır. Formaldehit molekülü çoğunlukla, proteinlerin N-terminali ile etkileşir ve protein molekülleri arasında metilen köprüleri (H-C-H) oluşturur. N-terminali ile olan bu reaksiyonun, formalin solüsyonlarının pH’sına ve aa’lerin biyokimyasal özelliklerine bağlı olduğu düşünülmektedir. Formaldehit ayrıca aa sisteini içindeki sülfidril gruplarına da bağlanarak, proteinleri daha ileri stabilize eden çapraz bağlar oluşturur. Bu köprüler ve çapraz bağlar, dokuyu stabilize edip korumakla birlikte, çeşitli İHK prosedürlerinde epitop açığa çıkarma (retrieval) basamağına ihtiyaç duyuran oluşumlardır.

Formalin fiksatif olarak kullanılırken, solüsyonun pH’ı dikkat edilmesi gereken özelliklerdendir. Yukarıda da belirtildiği gibi, formalin solüsyonu olağan pH aralığında iken, formaldehit molekülleri normal olarak proteinlerin N-terminal ucu ile bağlanacaktır. Bu pH, genelde nötrale yakındır. Bir formaldehit solüsyonunun pH’ı çok asidik olduğunda, bu solüsyona maruz kalan kanlı dokularda, asidik ortamın hemoglobin üzerinde yaptığı etki sonucu, koyu kahverengi/siyah renkli, insolubl, yapay bir pigment oluşur. Bu pigment hematin (asit hematin, formalin pigmenti, formene) olarak isimlendirilir. Bu nedenlerle, formalin solüsyonlarının pH’ı genelde 6’nın üzerinde tutulur.

Formalin, atmosferik oksijene maruz kaldığında formik aside oksidize olmaya meyilli olduğundan, solüsyonların çoğu hematin pigment oluşumunu inhibe etmek için tamponlanır. Yaygın olarak kullanılan tampon fosfattır (5). Etkili bir tamponlayıcı olmakla birlikte, fosfatı formalin içinde kullanırken, fosfat çökeltisi oluşumunu önlemek amacı ile, dehidrasyon işlemi maksimum %70 konsantrasyonda başlanmalıdır. Bu çökeltiler, dokuda yapay kalıntılara neden olabilir ve daha fazlası, alkol tüpünde blokaja neden olabilir. Bu oluşumu önlemek için, ilk alkolü %70 ya da daha düşük tutmaya ek olarak, fosfat dışında bir başka tampon ile tamponlanmış formalin solüsyonu da kullanılabilir. Bu fiksatifler fosfat-tamponlularla aynı sonuçları verir ve fosfat çökelti oluşumu problemi de olmaz.

Kronik Hepatitte Skorlama Amaci

Kronik Hepatitte Skorlamanın Amacı

Kronik hepatitlerde skorlama;

-     Kronik hepatit morfolojisinin şiddetini (derece) ve progresyonunu (evre) belirlemek,

-     Tedavi öncesi ve sonrası biyopsi karşılaştırılmasını yapmak,

-     Yeni tedavi protokollerinin değerlendirmek amacıyla kullanılır.

Pratik amaçlarla skorlama sistemi basit, uygulanabilir ve klinik açıdan amaca uygun olmalıdır.

KVH - Antiviral Tedavi ve Tedavi Başarısını Belirleyen Parametreler

HBeAg negatif KBH’de spontan veya tedavi sonrası HBeAg temizlenme ve anti-HBe serokonversiyon, uzun süreli ve yavaş replikasyon sonucu oluşmaktadır (KVY). HBeAg negatif KBH’de antiviral tedavide amaç, virolojik/biyokimyasal yanıtın HBV-DNA değerinde azalma veya yok olma, aminotransferaz düzeylerinin normalleşmesidir (6). Uzun süre interferon (İFN), tedavide tek ilaç idi. Günümüzde interferon-α veya nukleoz(t)id analogları ilaçlar kullanılmaktadır.

KCH’de   tedavideki   ana   amaç,   48   hafta   süren   tedavi   sonrası   HCV   RNA kaybıdır. Tedavide (peg)interferon ve/veya ribavirin kullanılmaktadır.

KVH (Kronik Viral Hepatit) ve Skorlama Tarihçesi

KVH (Kronik Viral Hepatit) ve Histopatoloji ve Skorlama Tarihçesi

Kronik hepatitlerde ilk sınıflama 1968’de De Groote J ve arkadaşları tarafından tanımlandı.

Bu sınıflamaya yapılan modifikasyonla (55) KVH, kronik persistan hepatit (KPH), kronik aktif hepatit (KAH) ve kronik lobüler hepatit (KLH) olarak üç gruba ayrıldı. Daha sonra viral etkenlerin belirlenmesi, tanı ve tedavi seçeneklerinin artması yeni sınıflama gerekliliği doğurdu. Bu konuda ilk adımı Knodell ve ark. yaptı. Bu skorlamaya göre değerlendirme 4 kategoride yapılmakta ve sonra toplanan puanlarla hepatik aktivite indeksi (HAI) olarak tanımlanan derece belirleniyordu. Ancak fibrozis (evre) ve iltihabi değişikliklerin (derece) bir arada değerlendirilmesi, patogenezlerinin farklı olduğu düşünülen iki parametrenin (periportal inflamasyon ve köprüleşme nekrozu) bir arada değerlendirilmesi, ayrıca skorlamada sıra numarasının ardışık olmaması gibi matematiksel sıkıntılar zaman zaman patologlar için sorun yaratıyordu. Daha sonra Ishak ve ark. konfluent nekrozu nekroinflamatuar değerlendirmede 4. kriter olarak kabul ettiler ve evre ayrıca belirtilmeye başlandı . “Piecemeal nekroz”da izlenen hepatosit hasarının litik nekrozdan ziyade apoptoz olduğu düşünüldüğünden bu bulgunun interfaz hepatit olarak adlandırılması uygun görüldü.

 Sonrasında farklı yazarlar literatürde yeni skorlama yöntemlerini yayınladı. Bunlara örnek olarak Scheuer, Fransız METAVIR grubu, Kenneth Batts ve Jurgen Ludwig skorlamaları örnek gösterilebilir.

HDV Hepatit D Virusu Nedir

HDV (Hepatit D Virüsü) Nedir

HDV enfeksiyonu rastlanma oranı, Güney İtalya’da HBsAg taşıyıcıları arasında %8 iken, Afrika ve Orta Doğu’da %40’lara kadar çıkmaktadır. ABD’de en sık, ilaç bağımlılarında ve çok sayıda transfüzyon ihtiyacı olan kişilerde rastlanmaktadır (rastlanma sıklığı %1-10).

HDV, replikasyon defektine sahip olan bir RNA virüsüdür. HDV, bu replikasyon defekti nedeniyle sadece HBsAg ile kapsüle olduğunda enfeksiyona neden olabilir. HDV’nin üremesi için HBV ko-enfeksiyonu varlığı gerekmektedir. HDV hepatit, akut enfeksiyon (örneğin: hem HBV hem HDV içeren serum) veya HBV taşıyıcısının HDV ile süperenfeksiyonu şeklinde ortaya çıkar.

Karaciger Igne Biyopsisi ve Kronik Hepatit

Kronik Hepatit - Karaciğer İğne Biyopsisi

Kronik hepatit tanısının konulmasında biyokimyasal ve/veya moleküler yöntemler ve/veya karaciğer iğne biyopsisinin yapılması gereklidir. Özellikle karaciğer iğne biyopsisinin gerekli olduğu durumlar aşağıda belirtilmektedir

Karaciğer iğne biyopsi endikasyonları

-     Diğer     yöntemlerle     açıklanamayan     anormal     karaciğer     testleri: Granülomatöz hepatit, öykü ve serolojik bulgular olmaksızın kronik hepatit, bazı ilaçlar etkisiyle oluşan kronik hepatit tablosu 

-     Bilinmeyen     orijinli     ateş:     Mikobakterial     enfeksiyonlar,     CMV, histoplazmoz, kandidiaz, toksoplazmoz, sarkoidoz, brüsellöz, enfeksiyöz mononükleoz, lenfomalar, metastatik karsinom ekartasyonu

-     Sistemik inflamatuar veya metabolik hastalıklar

-     Kronik karaciğer hastalıklarının değerlendirilmesi ve derecelendirilmesi

-     İlaç nedeniyle oluşmuş karaciğer zedelenmesinin değerlendirilmesi

-     Yer kaplayan lezyonların tanımlanması

-     Açıklanamayan hepatomegali ve/veya hafif hepatik disfonksiyon 

gibi durumlarda karaciğer iğne biyopsisi vazgeçilmez tanı yöntemi olabilir. Ülkemizde ve diğer ülkelerde karaciğer iğne biyopsisi en sık KVH’nin tanı ve tedavisi için yapılmaktadır.

Karaciğer iğne biyopsileri, özellikle KVH tanısından ziyade mevcut hastalığın şiddetini (evre ve derecesini) ve KVH ile birlikte başka bir hastalık olasılığını ekarte etmek için önemlidir. Evre herhangi bir hastalığın ne kadar ilerlediğini, derece ise hastalığın son evreye hangi hızla ilerlediğini göstermektedir (35). Kronik karaciğer hastalıklarında son evre klinik dekompensasyona uyan sirozu temsil etmekteyken, erken evre daha az miktarda fibrozis ile karakterizedir. 

Birçok kronik hastalıkta yeterli bir histopatolojik değerlendirme için iğne biyopsilerinde boyut ve direngi noktası olan portal alan sayısı önemlidir. Boyut açısından ele alındığında, uzunluğunun 1,5 cm olması gerekmektedir. Özellikle KCH için son yayınlar, 2,5 cm’den küçük iğne biyopsilerde evreleme hatasının olabileceğini göstermektedir (10,21). İğne biyopsisindeki mevcut portal alan sayısı da yeterlilik değerlendirmesi için başka bir önemli parametredir. Bu değerlendirmede en az 6 portal alanın gerekli olduğu görüşü yanı sıra en az 11 portal alan olması gerektiğini söyleyen bilgiler mevcuttur (10). Bu kriterlere sahip olmayan karaciğer iğne biyopsilerinin raporda belirtilmesi gerekmektedir.

HBV Hepatit B Virusu Nedir

HBV (Hepatit B Virüsü) Nedir

HBV tahmini olarak 400 milyonluk taşıyıcı oranı ile tüm dünyada büyük bir problem oluşturmaktadır. HBV’nin günümüzde 2 trilyon insanı hayatlarının bir döneminde enfekte ettiği tahmin edilmektedir. HBV’nin neden olduğu hastalıklar:

-     Tam   iyileşmenin   gerçekleştiği   ve   virüsün   tamamen   temizlendiği   akut hepatit

-     Siroz ile sonuçlanabilen kronik ilerleyici hepatit

-     Masif karaciğer nekrozu ile seyreden fulminan hepatit

-     Progresif    subklinik    hastalıkla    beraber    ya    da    ondan    bağımsız    kronik taşıyıcılık.

Kronik taşıyıcıların %80’i Asya ve Batı Pasifik bölgelerinde yaşamaktadır. ABD’de her yıl 46,000 yeni enfeksiyon bildirilmektedir. HBV enfeksiyonu, akut enfeksiyon, iyileşme, fulminan hepatit, kronik hepatit ile sonuçlanabilir. KBH’de siroz %12-20 oranında izlenmekte olup, sirozlu hastaların %6-15’inde hepatosellüler karsinom gelişmektedir (58).

HAV’den farklı olarak HBV uzamış inkübasyon süresinin (4-26 hafta) son dönemlerinde, akut ve kronik hepatitin aktif epizotları süresince kanda pozitiftir. Bütün vücut sıvılarında mevcut olan HBV, dışkıda bulunmaz. Kan ve vücut sıvıları ana bulaş yollarıdır, ancak meni, tükürük, gözyaşı, süt ve patolojik efüzyonlar gibi vücut salgıları ile temas yoluyla da geçebildiği bildirilmiştir. Yaygın endemik bölgelerde anneden bebeğe doğum sırasında vertikal geçiş başta gelen bulaşma yoludur. Daha az endemik olan bölgelerde ise transfüzyon, kan ürünleri, diyaliz, sağlık çalışanlarının uğradığı iğne batması gibi kazalar, intravenöz ilaç alışkanlığı ve cinsel ilişki (homoseksüel ve heteroseksüel) gibi horizontal geçiş yolları HBV enfeksiyonu için primer bulaşım mekanizmalarıdır. Hastaların üçte birinde enfeksiyon kaynağı saptanamaz. Enfeksiyon erişkinlerde genellikle iyileşir, fakat vertikal geçiş yüksek oranda kronik enfeksiyon ile sonuçlanır.

HBV, DNA içeren ve birçok hayvan türünde karaciğer enfeksiyonuna neden olan Hepadnaviridae grubunun bir üyesidir. HBV replikasyonu virüsün konak hücrenin genomuna entegre olmasını gerektirmez, fakat hücrelerde sıklıkla entegre olmuş HBV DNA’sı bulunur. HBV genomu, çift zincirli sirküler bir DNA molekülüdür. Sahip olduğu 3200 nükleotid aşağıdakileri kodlar:

•    Nükleokapsid “core” proteinin precore/core bölgesi (HBcAg) ve pre-core proteini (HBeAg): HBcAg enfekte hepatosit içinde kalır, HBeAg ise kana salınarak bağışıklık sistemi için antijenik bir uyarı oluşturur.

•    Zarf glikoproteini (HBsAg): Çok büyük miktarlarda üretilip kana salınabilir. Kandaki HBsAg immünojeniktir, küre ya da tübül şeklinde gözlemlenebilir.

•    DNA polimeraz: Ters (“reverse”) transkriptaz aktivitesi vardır. Genomun replikasyonu, pregenomik RNA olarak adlandırılan intermediyer bir RNA sayesinde gerçekleşir.

•    HBV-X proteini: Birçok viral ve konak hücre genlerinin transkripsiyonel transaktivatörü olarak rol oynar. HBV-X virüsün infektivitesi için gereklidir. Ayrıca p53 yıkımını ve ekspresyonunu kontrol ederek hepatosellüler karsinom gelişiminde de rol oynar.

Virüse maruz kalınmasından sonraki asemptomatik 45-160 günlük (ortalama 120 gün) inkübasyon dönemini, haftalar ya da aylar süren akut hastalık dönemi izler. Akut hastalığın doğal süreci serum belirteçleri ile izlenebilir:

•     Semptomların ortaya çıkışından önce kanda saptanan HBsAg hastalığın belirgin olduğu dönemde en yüksek seviyededir. İmmün yanıtla birlikte 3-6 ay içerisinde kanda saptanamayacak seviyelere düşer.

•    Anti-HBs antikoru, akut hastalık geçinceye kadar yükselmez ve genelde HBsAg’nin kanda yok olmasından sonraki birkaç hafta-ay içinde saptanabilir seviyelere ulaşmaz. Anti-HBs hayat boyu kalır ve korunmayı sağlar. Bu durum günümüzdeki rekombinant HBsAg’ni partikülleri kullanarak aşılama stratejilerinin temelini oluşturmaktadır.

•    HBeAg, HBV-DNA ve DNA polimeraz, HBsAg’den kısa bir süre sonra serumda belirir ve aktif viral replikasyonun varlığına işaret eder. HBeAg’nin serumda varlığı, devam eden viral replikasyonu, infektiviteyi ve olası kronik hepatit gelişimini gösterir.

•    IgM anti-HBc, semptomların başlangıcından kısa bir süre önce, hepatosit hasarının göstergesi olan serum transaminaz seviyelerinin yükselmesi ile eş zamanlı olarak serumda saptanabilir düzeylere gelir. Aylar içerisinde IgG anti-HBc antikoru, IgM anti-HBc antikorunun yerini alır.

Bazen HBeAg sentezleyemeyen, fakat replikasyon yapabilen ve HBcAg eksprese edebilen infeksiyöz bir HBV türü enfeksiyona neden olabilir. Bu hastalarda HBV viral yükü olmasına rağmen HBeAg seviyesi saptanamayacak kadar düşük olabilir. Diğer bir kötü durum ise aşı kaynaklı mutantların ortaya çıkışıdır. Bunlar aşı ile sağlanmış bir bağışıklık ortamında replike olabilirler. Örneğin, HBsAg’nin 145. aminoasiti olan argininin yerine glisin yerleşmesi, HBsAg’nin anti-HBsAg antikorları tarafından tanınmasını önemli ölçüde engeller.

KBH’de ayırıcı morfolojik özelliklerden biri buzlu cam görünümüne sahip hücrelerin varlığıdır. Buzlu cam hücreleri, periferal şeffaf halka ile çevrili ince granüler eozinofilik sitoplazma ile karakterizedir. Klasik buzlu cam hücreleri, düz endoplazmik retikuluma bağlı HBsAg içermektedir. Morfolojik olarak benzer değişiklikler, düz endoplazmik retikulum hiperplazisi ve enzim induksiyonu, sianamid tedavisi, miyoklonus epilepsisi (Lafora cisimcikleri), fibrinojen depolanması veya tip IV glikojenozlarda görülebilir. Nükleer HBcAg birikimi hepatosit nükleuslarında ince granuler inklüzyonlara (“kum” nükleus) neden olur (40). İmmünohistokimyasal olarak hepatositlerde HBsAg ekspresyonu kronisiteyi, HBcAg’nin ister sitoplazmik, ister nükleer boyanması aktif viral replikasyonun göstergesidir

Enfeksiyonun gidişini belirleyen en önemli faktör virüse karşı gelişen konak bağışıklık cevabıdır. Enfeksiyonun ilk dönemlerinde konağı koruyan doğal bağışıklık mekanizmaları ve virüse spesifik olan CD4+ ve CD8+ interferon-γ üreten hücrelerin güçlü cevabı akut enfeksiyonun iyileşmesini sağlar. HBV’nin direkt hepatosellüler hasara neden olmadığına inanılmasının çeşitli nedenleri vardır. Bunlardan en önemlisi, birçok kronik taşıyıcının hepatositlerinde virionları içerdikleri halde hücre hasarına ait en ufak belirtinin olmamasıdır. Hepatosit hasarının CD8+ sitotoksik T hücrelerinin virüsle enfekte hücrelere saldırması sonucu meydana geldiğine inanılmaktadır. Sonuç olarak, yaygın karaciğer hasarına neden olmadan virüsü temizleyebilmesi için bağışıklık cevabının çok iyi düzenlenmesi gereklidir.

HBV, aşılama ya da bağış yapılan kan, organ ve dokuların taranması ile engellenebilir. Aşı, maya içerisinde üretilen saflaştırılmış HBsAg’den hazırlanır. Aşılama bebek, çocuk ve adolesanların %95’inde koruyucu anti-HBs antikor üretimini başlatır. Geniş aşı programları Taiwan ve Gambia’da oldukça başarılı olmuş, ancak bu başarı tüm dünyada elde edilememiştir.